RNAcocktail 2.0 流程使用说明

此流程是 2017.07 发表在 Natue Communications 的 RNA-seq 流程。

RNAcocktail 2.0 对二代数据 RNA-seq 中的 alignment, transcriptome reconstruction, denovo transcriptome assembly, alignment-free quantification, differential expression analysis, variant calling 进行重新封装，统一配置文件。整个流程用 conda 进行环境管理。

Publication

If you use RNACocktail in your work, please cite the following:
Sayed Mohammad Ebrahim Sahraeian, Marghoob Mohiyuddin, Robert Sebra, Hagen Tilgner, Pegah T. Afshar, Kin Fai Au, Narges Bani Asadi, Mark B. Gerstein, Wing Hung Wong, Michael P. Snyder, Eric Schadt, and Hugo Y. K. Lam
Gaining comprehensive biological insight into the transcriptome by performing a broad-spectrum RNA-seq analysis Nature Communications 8, Article number: 59 (2017). doi:10.1038/s41467-017-00050-4

流程工具及输出文件

Short Reads	Tools	Output Files
alignment	HISAT2	alignments: alignments.sorted.bam junctions: splicesites.tab
transcriptome reconstruction	StringTie	trasncripts: transcripts.gtf expressions: gene_abund.tab
denovo transcriptome assembly	Oases	trasncripts: transcripts.fa
alignment-free quantification	Salmon-SMEM	expressions: quant.sf
differential expression analysis	DESeq2	differential expressions: deseq2_res.tab
variant calling	GATK	variants: variants_filtered.vcf

目录结构

|-- configure
|   |-- advanced_parameters.json
|   |-- conda_rnacock_simple.txt
|   |-- general_parameters.json
|   `-- seq_name.txt
|-- RNA_pipeline
|   |-- 01_short_read_alignment
|   |-- 02_short_read_reconstruction
|   |-- 03_alignment_free_transcript_quantification
|   |-- 04_differential_analysis
|   |-- 05_denovo_assembly
|   `-- 06_variant_calling
`-- template.sh

使用说明

SZ 集群：USER/guojiao1/Project/RNAcocktail_test/rnacocktail/ ( 以下称 ./ )

QD 集群：USER/guojiao1/pipeline/rnacocktail/RNAcocktail_test/rnacocktail/ ( 以下称 ./ )

1. 将 ./configure 和 ./template.sh 拷贝至自己的工作目录中

2. 在 ./configure/general_parameters.json 中配置基本参数（如有其他参数需求，请在 advanced_parameters.json 中设置）

3. 在 ./configure/seq.txt 中配置 reads 路径，不同 lanes 以回车键分隔

4. 运行 sh template.sh 将在 ./RNA_pipeline/ 中生成 6 个目录，分别是：

   • 01_short_read_alignment/（vf=25g）
   • 02_short_read_reconstruction/（vf=5g）
   • 03_alignment_free_transcript_quantification/
   • 04_differential_analysis/
   • 05_denovo_assembly/ ( 峰值内存大小与转录组数据有关, 850X 数据约 300g )
   • 06_variant_calling/

   括号内是估计的使用内存大小。

5. 可以新建 ./runlog，在对应的目录中投递或运行任务。

内容与使用的软件

内容	方法 1	方法 2
转录本定量	01-02 (stringtie)	03 (salmon)
差异表达	01-02-04 (stringtie) 根据是否有参考基因组 ref_gtf 选择 STEP04_02(有) 及 STEP04_03(无)	03-04(/STEP04_01) 需要 ref_gtf
转录本组装	01-02 (stringtie) 有参组装	05 (oases) 无参组装
Call variant	01-02-06 (GATK)	-

configure 目录说明

configure 目录中共有 4 个文件

1. general_parameters.json

   基本参数设置

2. advanced_parameters.json

   高级参数设置

3. seq_name.txt

   reads 目录。

   支持 PE reads，SE reads 及 SRA accession numbers(DRR/SSR/ERR) 输入，不同样本以换行符分隔。 以 PE reads 为例：_1.fastq.gz, _2.fastq.gz。

4. conda_rnacock_simple.txt（搭建流程用）

   含有流程中用到的主要软件，不需要改动。 如需重新搭建，使用 conda env create -n rnacock_2 --file ./configure/conda_rnacock_simple.txt 为避免冲突，建议新建一个环境单独安装 R 包（conda create -n r-test bioconductor-deseq2=1.16.1 r-readr bioconductor-tximport）

参数说明

General_Arguement（流程中通用参数）

1. sample 样品编号，重复样品以 , 分割，不同阶段或组织的样本以空格分隔。 例："A1,A2 B1,B2"：A, B 代表不同样品，A1, A2 为重复样本。 若没有重复样本，不能做差异表达。
2. threads

Number of threads to use（默认为 4）

3. start 从流程中某一步开始运行（默认为 0）
4. work_dir

结果目录及其他文件目录（需要写入权限）

5. large_genome

基因组大小如果 >4g，请设置为 True。此项设置为 True 时只支持 PE reads

Short_Read_Alignment

1. ref_genome_fa

参考基因组

2. align_idx
   index 目录
3. ref_gtf
   参考基因组 .gtf 文件，若无，此项设为 "''"
4. hisat2_sps
   若没有 ref_gtf，此项设为 "''"

Short_Read_Transcriptome_Reconstruction

1. stringtie_opts
   stringtie 参数

Alignment_free_quantification

1. threads_salmon
   salmon 运行 threads 数量，至少设为 4
2. transcriptome_fa
   参考转录组 fa 文件，若无，此项无需改动
3. quantifier_idx
   salmon index 索引位置
4. salmon_k
   SMEM's smaller than this size will not be considered by Salmon. (default 19)
5. libtype
   Format string describing the library type. (For Salmon check here)

Differential_Analysis

1. mincount
   Minimum read counts per transcripts. Differential analysis pre-filtering step removes transcripts that have less than this number of reads. (default 2)
2. alpha_float
   Adjusted p-value significance level for differential analysis. (default 0.05)

De_novo_assembly

1. assembly_hash
   Odd integer, or a comma separated list of odd integers that specify the assembly has length (for Oases/Velvet).
2. read_type
   Input sequence read type for de novo assembly Options: short, shortPaired, __short2, shortPaired2, long, longPaired, reference. (Check here for description) (default short)
3. file_format
   Input file format for de novo assembly Options: fasta, fastq, raw, fasta.gz, fastq.gz, raw.gz, sam, bam, fmtAuto. (default fasta)

Variant Calling

1. knownsites
   A database of known polymorphic sites (e.g. dbSNP). Used in GATK BaseRecalibrator and RealignerTargetCreator. NOTE: to run BaseRecalibrator step knownsites should be provided.

其他参数设置详见原流程网址

• Template_configure 模版配置参数，无需改动！

1. template_path
   模版路径
2. template_header 生成的 shell 文件中的 header

输出结果 (out_dir) 说明

hisat2

• alignments.sorted.bam

  经过排序的 bam 文件

• splicesites.tab

  hisat2 的剪切位点信息（包括根据参考基因组 ref_gtf 得到的剪切位点）

• splicesites.bed

  经 hisat2_jun2bed.py 将剪切位点转换成 bed 文件

stringtie

• transcripts.gtf

  基因注释文件

• gene_abund.tab

  stringtie -A 生成基因丰度文件

salmon_smem

• quant.sf 基因定量文件，每一列如下： (1) Name：提供的目标转录本 ID (2) Length：目标转录本长度 (3) EffectiveLength：目标转录本有效长度，考虑了插入片段长度分布和序列特异性等 (4) TPM：transcripts per million，TPM 计算公式中分母是总转录本数量的统计量，而 FPKM 和 RPKM 分母仅仅代表测序深度的变化 (5) Numreads：map 到每个转录本的 reads 数量

deseq2

• deseq2_res.tab，差异表达结果，每列含义如下： (1) rownames：基因 ID
  (2) baseMean：样本矫正后的平均 reads 数
  (3) log2FoldChange：表达量差异取 log2 后的值
  (4) lfcSE: standard error: condition treated vs untreated
  (5) stat：Wald statistic Wald 检验统计量
  (6) pvalue：统计学差异显著性检验指标
  (7) padj：校正后的 pvalue，padj 越小，表示基因表达差异越显著

oases

• transcripts.fa 无参组装得到的转录本

注意事项

1. 在配置文件中，如果设置某个参数为空，请设置为 "''"，而非 ""。
2. json 文件说明，见链接 (字符串使用 双引号("")，最后一个元素最后不能加逗号)。
3. 除特殊情况外，只进行基本参数设置（general_parameters.json）即可。
4. Hisat 比对索引文件默认在 ref_genome_fa 目录中生成，如果采用默认配置，目录需要有写入权限，也可以在 advanced_parameters.json 中配置路径。
5. Salmon 比对索引文件默认在 transcriptome_fa 目录中生成，如果采用默认配置，目录需要有写入权限，也可以在 advanced_parameters.json 中配置。
6. work_dir 目录权限必须是可写入。
7. 流程会分别在 out_dir 和 work_dir 中生成结果文件，如果产生较大的结果文件（如 *.bam 等），请在流程结束后删除。

更新说明

• 2017.11.15 增加 -s 参数，指定每个部分开始的 step
• 2017.11.17 添加功能：删除 oases 结束后产生较大的临时文件 (*.Graph2等)
• 2018.04.25 增加 reads 中 *.fastq.gz 格式支持
• 2018.05.10 增加 advanced_parameters.json 中 out_dir 目录设置
• 2018.05.23 增加 advanced_parameters.json 中 large_genome 参数
• 2019.04.16 修复参数 transcriptome_fa 和 ref_genome_fa 为 "''" 时，创建目录报错 bug。
• 2019.05.17 修复 Salmon 接受 fastq 文件时，unzip 会出现 bug

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